Улавливание тонкостей активности мозга требует разрешения, масштаба и скорости — способности визуализировать миллионы нейронов с кристально чистым разрешением, когда они активно обращаются из дальних углов коры головного мозга с разницей в доли секунды.
Теперь исследователи разработали новый метод микроскопии , который позволит ученым совершить этот подвиг, получая подробные изображения активности огромного количества клеток на разных глубинах мозга с высокой скоростью и с беспрецедентной четкостью. Исследование, опубликованное в журнале Nature Methods , демонстрирует мощь этого нововведения, получившего название микроскопии световых шариков, путем представления первых ярких функциональных видеороликов о почти одновременной активности одного миллиона нейронов в мозгу мыши.
«Понимание природы плотно взаимосвязанной сети мозга требует разработки новых методов визуализации, которые могут фиксировать активность нейронов в сильно разделенных областях мозга с высокой скоростью и разрешением одной клетки», — говорит Алипаша Вазири из Рокфеллера. «Световая микроскопия позволит нам исследовать биологические вопросы так, как это было невозможно раньше».
Содержание
Акцент на новый метод микроскопии
Будь то усы, которые ищут опасности, качаясь взад и вперед, или координация рук и глаз, которая помогает человеку отбивать бейсбольный мяч, животные полагаются на зов и реакцию сенсорных, моторных и визуальных областей мозга. Клетки из далеких участков коры координируют этот подвиг через сеть нейроактивности, которая сплетает отдаленные области мозга во взаимосвязанные симфонии.
Ученые только сейчас начинают распутывать эту паутину с помощью передовых микроскопов. Комбинация двухфотонной сканирующей микроскопии и флуоресцентных меток является золотым стандартом, когда дело доходит до визуализации активности нейронов в менее прозрачных тканях мозга, которые склонны к рассеиванию света. Он включает в себя стрельбу сфокусированным лазерным импульсом по помеченной цели. Через несколько наносекунд после того, как импульс достигает своей отметки, метка излучает флуоресцентный свет, который можно интерпретировать, чтобы дать ученым представление об обнаруженном уровне нейроактивности.
Но двухфотонная микроскопия страдает фундаментальным ограничением. Нейробиологам необходимо записывать одновременные взаимодействия между сенсорной, моторной и зрительной областями мозга, но сложно зафиксировать активность в таком широком диапазоне мозга, не жертвуя разрешением или скоростью.
Создание идеального микроскопа для визуализации взаимодействий между удаленными друг от друга областями мозга может напоминать затыкание дыр в тонущем корабле. В интересах высокого разрешения ученым часто приходится жертвовать масштабом или уменьшать масштаб, чтобы рассмотреть более крупную структуру, за счет разрешения. Это можно преодолеть, сделав серию изображений с высоким разрешением из отдаленных уголков мозга по отдельности, а затем сшив их вместе. Но тогда скорость становится проблемой.
«Нам нужно одновременно захватить множество нейронов в отдаленных частях мозга с высоким разрешением», — говорит Вазири. «Эти параметры практически исключают друг друга».
Инновационное разрешение
Световая микроскопия предлагает творческое решение и раздвигает пределы скорости визуализации до максимально достижимых — ограничивается только физической природой самой флуоресценции. Это достигается за счет устранения «мертвого времени» между последовательными лазерными импульсами, когда нейроактивность не регистрируется, и в то же время необходимости сканирования.
Техника включает разбиение одного сильного импульса на 30 более мелких субимпульсов — каждый с разной силой — которые погружаются в 30 разных глубин рассеянного мозга мыши, но вызывают одинаковое количество флуоресценции на каждой глубине. Это достигается за счет полости зеркал, которая смещает срабатывание каждого импульса во времени и гарантирует, что все они могут достичь заданной глубины с помощью одной фокусирующей линзы микроскопа. При таком подходе единственным ограничением скорости записи образцов является время, необходимое флуоресцентным меткам для вспышки. Это означает, что широкие участки мозга могут быть записаны за то же время, которое потребовалось бы с помощью обычного двухфотонного микроскопа, чтобы захватить лишь небольшую часть клеток мозга.
Затем Вазири и его коллеги проверили микроскопию световых шариков, интегрировав ее в платформу для микроскопии, которая обеспечивает оптический доступ к большому объему мозга, позволяя регистрировать активность более одного миллиона нейронов по всей коре головного мозга мыши для первый раз.
Поскольку метод Вазири является нововведением, основанным на двухфотонной микроскопии, многие лаборатории уже имеют или могут получить на коммерческой основе технологии, необходимые для выполнения микроскопии световых шариков, как описано в статье. Лаборатории, которые менее знакомы с этими методами, могут извлечь выгоду из упрощенного, автономного модуля, который в настоящее время разрабатывает Vaziri для более широкого использования. «Нет веской причины, по которой мы не сделали этого пять лет назад», — говорит он. «Это было бы возможно — микроскоп и лазерная технология существовали. Никто об этом не подумал».
В конечном итоге цель состоит в том, чтобы дополнить, а не заменить существующие методы. «Есть нейробиологические вопросы, для которых достаточно стандартного двухфотонного микроскопа», — говорит Вазири. «Но микроскопия с помощью световых шариков позволяет нам решать вопросы, которые не могут дать существующие методы».
Материалы Рокфеллеровского университета
